2.5 对银杏蛋白螯合亚铁离子能力的杏蛋性及性影响
亚铁离子等过渡态金属离子可催化机体中的Fenton反应，引发脂质过氧化并产生羟基自由基，白功螯合亚铁离子能力是抗氧评估受试物抗氧化活性的常用方法之一。不同提取方法对银杏蛋白螯合亚铁离子能力的化活影响如图4所示。三种银杏蛋白均表现出较好的影响亚铁离子螯合能力，且与质量浓度呈正相关。杏蛋性及性在质量浓度为2.0g/L时，白功WEAP、抗氧AEAP和UA-AEAP蛋白对亚铁离子的化活螯合率分别为21.78%±0.78%、12.92%±0.46%和18.78%±0.58%，影响而质量浓度增加至8.0g/L时，杏蛋性及性螯合率分别提高到68.54%±3.01%、白功67.68%±3.21%和73.28%±3.45%。抗氧在低质量浓度时，化活三种银杏蛋白对亚铁离子螯合能力的影响顺序为WEAP＞UA-AEAP＞AEAP；而当质量浓度超过3.0g/L时，UA-AEAP的螯合能力则高于WEAP和AEAP。银杏蛋白对亚铁离子的螯合能力可能是因为氨基酸残基中的羧基等基团与亚铁离子发生了配位反应。UA-AEAP蛋白具有更强的亚铁离子螯合能力，可能是因为超声处理能够降低银杏蛋白聚集体的粒度，暴露出更多功能基团。许晶等研究表明，超声预处理也可显著提高大豆蛋白对亚铁离子的螯合能力。
某种受试物的IC50低于10g/L，则说明该受试物具有一定的抗氧化能力。利用Origin2018对图4数据进行非线性曲线拟合，得到WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白对DPPH自由基清除能力的对数曲线方程分别为y=-31.56+43.32ln（x+0.1.63），R2=0.9735，y=-57.88+53.008ln（x+2.15），R2=0.9719和y=-16.92+41.33ln（x+0.73），R2=0.9662。根据R2可知，拟合优度较好，由上述方程计算得出WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白对亚铁离子螯合能力的IC50分别为4.94、5.48和4.32g/L。由IC50可知，三种银杏蛋白对亚铁离子的螯合能力顺序为UAAEAP＞WEAP＞AEAP。阳性对照的IC50为0.09g/L，提示EDTA具有极强的螯合亚铁离子的能力。
2.6 对银杏蛋白清除DPPH自由基能力的影响
DPPH自由基清除能力是评估受试物抗氧化潜力的最常用方法之一，当DPPH自由基被受试物清除时，DPPH溶液的吸光度会降低，因此可用于评估受试物的清除自由基能力。不同提取方法对银杏蛋白清除DPPH自由基能力的影响如图5所示。在0.05～6g/L的质量浓度范围内，三种银杏蛋白的DPPH自由基清除率均与质量浓度呈正相关。当质量浓度为1g/L时，WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白对DPPH自由基的清除率分别为42.61%±2.14%、41.63%±3.23%和50.47%±1.95%；当质量浓度升高至为5g/L时，清除率分别提高到70.45%±2.36%、68.78%±2.56%和74.92%±2.28%。与WEAP和AEAP蛋白相比，UA-AEAP蛋白具有更强的DPPH自由基清除能力，可能的原因是超声处理能降低银杏蛋白的聚集度，暴露出更多的与自由基作用的基团。Ma等研究表明，超声处理可提高β-乳球蛋白对DPPH自由基的清除能力，这与本研究的结果相一致。
WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白对DPPH自由基清除能力的对数曲线方程分别为y=37.69+19.31ln（x+0.11），R2=0.9931，y=34.36+19.86ln（x+0.15），R2=0.9911和y=45.54+17.79ln（x+0.04），R2=0.9954。由上述方程计算得出WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白对DPPH自由基能力的IC50分别为1.78、2.05和1.24g/L，表明这三种银杏蛋白均具有较高的清除DPPH自由基能力，清除能力顺序为UAAEAP＞WEAP＞AEAP。抗坏血酸的IC50为0.08g/L，提示抗坏血酸具有极强的清除DPPH自由基能力。
2.7 对银杏蛋白清除羟基自由基能力的影响
羟基自由基被认为是目前已知的氧化能力最强和危害性最大的活性氧之一，可通过电子转移、加成和脱氢作用攻击机体内多种生物分子，从而导致蛋白质、核酸和脂质的氧化损伤。图6为不同提取方法对银杏蛋白清除羟基自由基能力的影响。由图可知，WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白对羟基自由基的清除活性与蛋白质量浓度呈正相关。在质量浓度为1.0g/L时，WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白对羟基的清除率分别为25.5%±0.82%、22.56%±0.74%和28.62%±1.21%；当质量浓度增加至8.0g/L时，清除率分别为73.96%±2.73%、68.52%±2.64%和78.94%±2.95%。由此可知，UA-AEAP蛋白具有更强的羟基自由基清除能力，这与前人研究结果相一致，大豆球蛋白经超声预处理后对羟基自由基的清除能力显著增强。银杏蛋白对羟基自由基的清除能力可能是因为氨基酸残基中的羧基等基团通过螯合亚铁离子而阻断Fenton反应，从而降低羟基自由基的产生。
WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白对羟基自由基清除能力的对数曲线方程分别为y=10.25+28.13ln（x+0.80），R2=0.9944，y=6.01+27.64ln（x+0.79），R2=0.9946和y=17.76+27.40ln（x+0.49）,R2=0.9904，计算出IC50分别为3.31、4.12和2.76g/L，由此可知，三种银杏蛋白对羟基自由基清除能力的顺序为UA-AEAP＞WEAP＞AEAP。抗坏血酸的IC50为0.80g/L，表明抗坏血酸具有极强的清除羟基自由基能力。
3 结论
不同提取方法对银杏蛋白得率的影响较大，其中UA-AEAP蛋白得率最高，达11.36%±0.10%，显著高于WEAP和AEAP。三种提取方法制备的银杏蛋白纯度均较高，可以满足功能特性分析的需要。银杏蛋白溶解度受到提取方法的影响，UA-AEAP蛋白的溶解度最高，WEAP蛋白的溶解度略高于AEAP蛋白。提取方法显著影响了银杏蛋白的起泡性、泡沫稳定性和乳化性等功能特性，而对乳化稳定性无显著性影响；UA-AEAP蛋白的起泡性、泡沫稳定性和乳化性均优于AEAP和WEAP蛋白。提取方法影响了银杏蛋白的抗氧化活性，银杏蛋白的螯合亚铁离子能力、清除DPPH自由基能力和清除羟基自由基能力的顺序均为：UA-AEAP＞WEAP＞AEAP。综上所述，UA-AEAP蛋白得率高、抗氧化能力和功能特性优于另外两种方法，更适于银杏蛋白的制备。本研究考察了提取方法对银杏蛋白功能特性及抗氧化活性的影响，为银杏蛋白在食品体系中的应用及功能性产品的开发提供了理论基础，后续将进一步研究不同提取方法对银杏蛋白氨基酸组成、二级结构、亚基组成、分子构象等结构的影响。
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